神經(jīng)元類型：確定培養(yǎng)的神經(jīng)元來源（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦皮層、海馬、小腦，或外周神經(jīng)系統(tǒng)的背根神經(jīng)節(jié)等），不同來源的神經(jīng)元分離方法和培養(yǎng)條件差異較大（如海馬神經(jīng)元較皮層神經(jīng)元更嬌弱，對營養(yǎng)要求更高）。
動物選擇：通常選用胚胎期（如大鼠E18-E20、小鼠E16-E18）或新生動物（如出生1-3天的大鼠/小鼠），因該階段神經(jīng)元增殖能力較強、分化程度低，更易存活；成年動物神經(jīng)元幾乎無增殖能力，培養(yǎng)難度極大。
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飼養(yǎng)：實驗動物需在SPF級（無特定病原體）環(huán)境中飼養(yǎng)，避免攜帶微生物污染細胞；飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22-25℃）、濕度（40%-60%）、光照周期（12h光/12h暗）需穩(wěn)定。
取材前確認：根據(jù)神經(jīng)元來源確定動物年齡（如海馬神經(jīng)元常用E18大鼠胚胎），取材前1天確認動物健康狀態(tài)（無腹瀉、脫毛等異常），并準備好euthanasia工具（如CO?麻醉裝置或頸椎脫臼工具，需符合倫理規(guī)范）。
（二）試劑準備
神經(jīng)元培養(yǎng)的試劑需保證無菌、低內(nèi)毒素，且需提前驗證批次穩(wěn)定性（尤其是血清、添加劑等關(guān)鍵成分）。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基
常用：Neurobasal Medium（神經(jīng)細胞專用，維持神經(jīng)元存活能力強）、DMEM/F12（混合培養(yǎng)基，適用于部分外周神經(jīng)元）。
處理：若為粉末狀需無菌配制（用超純水溶解，磁力攪拌至完q溶解），經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后分裝，4℃避光保存（避免反復(fù)凍融）。
血清與添加劑
血清：部分原代培養(yǎng)初期需添加胎牛血清（FBS，終濃度5%-10%）促進細胞貼壁，但純神經(jīng)元培養(yǎng)后期需去除血清（避免膠質(zhì)細胞過度增殖）；需選擇低內(nèi)毒素（<10EU/ml）、批次穩(wěn)定的血清，分裝后-20℃保存。
神經(jīng)專用添加劑：
B27 Supplement（常用，含維生素、抗氧化劑等，支持神經(jīng)元存活和突觸形成，終濃度2%）；
N2 Supplement（適用于部分神經(jīng)元，如多巴胺能神經(jīng)元，終濃度1%）；
其他：谷氨酰胺（神經(jīng)元代謝必需，終濃度2mM，需單獨分裝避免降解）、神經(jīng)營養(yǎng)因子（如NGF、BDNF，根據(jù)神經(jīng)元類型添加，促進特異性存活）。
消化與解離試劑
消化酶：用于分解組織間的蛋白質(zhì)連接，分離單細胞。
胰蛋白酶（0.125%-0.25%，適用于大部分神經(jīng)組織，需用不含Ca²?、Mg²?的平衡鹽溶液配制）；
木瓜蛋白酶（溫和，適用于敏感神經(jīng)元如海馬神經(jīng)元，需搭配DNase I（50-100μg/ml）減少細胞聚集）；
膠原酶（用于纖維結(jié)締組織較多的外周神經(jīng)組織，如背根神經(jīng)節(jié)）。
終止液：含血清的培養(yǎng)基（中和胰蛋白酶活性）或大豆胰蛋白酶抑制劑（STI，適用于無血清體系）。
平衡鹽溶液
用于洗滌組織、稀釋試劑，如PBS（不含Ca²?、Mg²?，避免影響消化酶活性）、HBSS（含葡萄糖，維持細胞活性），需無菌過濾，4℃保存。
抗生素與抗真菌劑
常用青霉素-鏈霉素混合液（終濃度100U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素），預(yù)防細菌污染；
若有真菌污染風(fēng)險，可添加兩性霉素B（終濃度2.5μg/ml），但需注意其對神經(jīng)元的潛在毒性，建議僅短期使用。
培養(yǎng)皿包被液
神經(jīng)元貼壁能力弱，需提前包被培養(yǎng)器皿以促進貼壁和生長：
多聚賴氨酸（PDL，常用，濃度50-100μg/ml，促進細胞黏附，用無菌水配制后過濾除菌，4℃保存）；
層粘連蛋白（Laminin，增強神經(jīng)元貼壁和突起延伸，常與PDL聯(lián)合使用，濃度10-20μg/ml，-20℃分裝保存，避免反復(fù)凍融）。
?。ㄈ┖牟呐c儀器準備
無菌耗材
培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)皿（6cm/10cm）、培養(yǎng)板（6孔、24孔、96孔，根據(jù)實驗需求選擇）、玻璃爬片（如需免疫熒光染色）。
其他：無菌離心管（15ml、50ml）、移液管（1ml/5ml/10ml，建議使用無菌一次性吸管）、手術(shù)器械（解剖剪、解剖鑷、眼科剪/鑷，需精細且鋒利，避免損傷組織）。
處理：
一次性耗材：確認包裝完好、無菌（如標注“STERILE”），開封后僅在超凈臺內(nèi)使用；
重復(fù)使用器械：用去離子水洗凈后，高壓蒸汽滅菌（121℃，20min），或用75%酒精浸泡后灼燒滅菌（使用前冷卻，避免燙傷組織）。
關(guān)鍵儀器
無菌環(huán)境：超凈工作臺（提前30min開啟紫外燈消毒，用75%酒精擦拭臺面，通風(fēng)后使用）；
培養(yǎng)設(shè)備：CO?培養(yǎng)箱（提前1-2天調(diào)試參數(shù)：溫度37℃±0.5℃，CO?濃度5%±0.5%，濕度≥95%，水箱加水（無菌去離子水或1%雙蒸水）防止干燥）；
其他：離心機（需無菌轉(zhuǎn)頭，提前預(yù)冷至4℃）、倒置顯微鏡（用于觀察組織解離和細胞狀態(tài)）、水浴鍋（37℃預(yù)熱試劑）、細胞計數(shù)板（或自動細胞計數(shù)儀）。
三、前期操作準備
試劑預(yù)熱與配制
基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、消化酶等需提前從冰箱取出，在37℃水浴鍋預(yù)熱（避免高溫破壞成分），平衡至室溫；
完q培養(yǎng)基：按比例混合基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、添加劑、抗生素（如100ml Neurobasal+2ml B27+1ml谷氨酰胺+1ml雙抗），無菌條件下配制，現(xiàn)配現(xiàn)用（剩余4℃保存，1周內(nèi)用完）。
培養(yǎng)器皿包被
步驟：無菌條件下，向培養(yǎng)皿/板中加入包被液（如PDL，覆蓋底部即可），37℃培養(yǎng)箱孵育1-2h（或4℃過夜）；
后續(xù)：棄去包被液，用無菌PBS洗滌2-3次，去除殘留包被液，晾干后立即使用（避免污染）。
無菌操作演練
操作人員需穿無菌實驗服、戴口罩、手套，袖口扎緊；
提前演練組織取材、解離的流程（如解剖工具的使用順序、離心轉(zhuǎn)速和時間控制），避免操作生疏導(dǎo)致細胞損傷或污染。
四、其他注意事項
污染預(yù)防：所有試劑瓶口、器械需用75%酒精消毒；超凈臺內(nèi)避免放置無關(guān)物品，操作時動作輕緩，避免揚塵；
時間控制：神經(jīng)元對缺氧、溫度變化敏感，從動物處死到細胞接種需控制在30-60min內(nèi)，避免組織長時間暴露在體外；
備用方案：準備額外的試劑和培養(yǎng)器皿，以防出現(xiàn)污染、試劑失效等突發(fā)情況。
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